Первый опыт трансплантации 3D-сфероидов ретинального пигментного эпителия в эксперименте

Авторы

  • С.А. Борзенок ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России; ФГБОУ «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России
  • Е.И. Хаценко ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России
  • Д.С. Островский ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России; ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»
  • М.Х. Хубецова ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России
  • А.В. Шацких ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России
  • И.Г. Трифаненкова ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России
  • М.А. Плахотний ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России
  • Е.В. Ерохина ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России

Ключевые слова:

ретинальный пигментный эпителий, 3D-сфероид,, возрастная макулярная дегенерация

Аннотация

Актуальность. На сегодняшний день традиционные методики лечения тяжелых форм возрастной макулярной дегенерации (ВМД) не
всегда позволяют добиться значимого улучшения зрения.
Новым перспективным методом лечения ВМД является трансплантация ретинального пигментного эпителия (РПЭ).
По нашему мнению, наиболее современной формой трансплантата РПЭ является многоклеточный сфероид – это форма 3D-клеточной культуры, в которой клетки приближены к условиям нативной ткани.
Однако трансплантация РПЭ в форме 3D-сфероидов требует проведения доклинических исследований.
Цель. Разработать технику трансплантации 3D-сфероидов РПЭ
на глазах экспериментальных животных (кролики).
Материал и методы. 1. Этап исследований in vitro. Для иммуноцитохимического исследования полученные 3D-культуры сфероидов
изучали на 3-е, 7-е и 11-е сутки сфероидогенеза (лазерный сканирующий конфокальный микроскоп «Fluo View FV10i», Olympus, Япония).
Оценивали экспрессию характерных эпителиальных маркеров (Alexa
Fluor, Великобритания), таких как: RPE-65, ZO-1, Цитокератин 8, 18, а
также мезенхимального маркера Виментина.
2. Этап исследований in vivo. Всем кроликам (n=10) выполняли витрэктомию (2500 резов в минуту, вакуум 600 мм рт.ст.), (Alcon, Accurus,
США). Далее острой канюлей 39G делали ретинотомическое отверстие выше места центральной зоны сетчатки и субретинально вводили сфероиды РПЭ (MicroDose injection kit 1 ml, Med One, США). Операции заканчивались заменой жидкости на воздух и наложением швов
на склеральные разрезы и конъюнктиву.
Методы послеоперационного контроля: ультразвуковое В-сканирование глаза (Ultrasonic UD-6000, Tomey, Япония) и оптическая когерентная томография (ОКТ), (Askin Spectralis, Heidelberg engineering,
Германия).
Животные выводились из эксперимента на 7, 10, 14 и 20 сутки
наблюдения путем воздушной эмболии. Глазные яблоки энуклеировались для последующего гистологического исследования.
Результаты. 1. Этап исследований in vitro. При проведении иммуноцитохимического окрашивания полученных 3D-культур отмечалось
наличие ярко выраженной экспрессии характерного высокоспецифичного маркера пигментного эпителия сетчатки RPE-65, а также эпителиальных маркеров Цитокератина 8, 18 и ZO-1. Экспрессия мезенхимального маркера Виментина была слабой, что свидетельствует о
преимуществе 3D-культивирования эпителиальных клеток для сохранения их эпителиального фенотипа.
2. Этап исследований in vivo. При проведении ультразвукового
В-сканирования в 1 сутки у 6 кроликов отмечалась плоская отслойка сетчатки в зоне оперативного вмешательства высотой до 1 мм, у
4 кроликов отмечалось прилегание оболочек, отслойка сетчатки не
визуализировалась.
ОКТ-картина морфологического состояния сетчатки была схожей
у всех экспериментальных животных – в течение первых 7 суток после хирургии в зоне оперативного вмешательства отмечался кистозный отек и плоская отслойка сетчатки. По мере наблюдения сетчатка прилегала и отек сетчатки уменьшался. Также на 3, 7 и 10 сутки
субретинально обнаруживались округлые конгломераты диаметром
от 60 до 80 мкм – предположительно 3D-сфероиды РПЭ. При проведении ОКТ на 14 и 20 сутки значимых изменений морфологического состояния сетчатки не наблюдалось.
По данным гистологического исследования отмечалась адгезия
сфероидов РПЭ к сосудистой оболочке с последующим распластыванием и образованием нового клеточного слоя по мере увеличения
сроков наблюдения.
Выводы. 1. Предложенная технология культивирования кроличьего РПЭ с последующим конструированием 3D-сфероидов позволяет сохранить эпителиальный фенотип клеток, что подтверждается
данными иммуноцитохимических исследований.
2. Разработанная хирургическая техника трансплантации РПЭ является приемлемой, что подтверждается данными оптической когерентной томографии и гистологическими исследованиями.
3. Предложенная хирургическая техника субретинальной трансплантации 3D-сфероидов РПЭ является перспективной для дальнейших экспериментальных исследований с целью внедрения в клиническую практику.

Загрузки

Опубликован

2021-08-12

Выпуск

Раздел

Статьи

Наиболее читаемые статьи этого автора (авторов)

1 2 3 4 5 > >>